연구논문 - 겨우살이

 

 

 

 

 

겨우살이

원문출처 : http://blog.naver.com/khg7100/20135016541

 

붉은겨울살이 (Viscum album for. rubroauranticum (Makino) Ohwi

 

● 겨우살이는 겨우살이과(Loranthaceae)에 속하는 다년생 기생식물로 북유럽에서 남아프리카까지 세계 전역에 걸쳐 약 30속 1,500여종이 다양하게 분포하고 있다.겨우살이는 기주식물로부터 수분과 무기물 및 유기물 등을 취해서 살아가는 피자식물인 동시에 자체적인 광합성 능력을 가지고 있어서 기주식물에 전적으로 의존하지 않는 반기생식물로 분류된다.

국내에서는 3속 6종 즉, 겨우살이(Viscum album var. colorautiacum (Kom)Ohwi), 붉은겨우살이(Viscum album for. rubroautiacum Ohwi), 뽕나무겨우살이(Loranthus parasaticus Merr), 참나무겨우살이(Loranthus yadoriki Sieb), 꼬리겨우살이(Loranthus tanakae FR et SAV), 동백나무겨우살이(Pseudixux japonicus)가 있다.

 

참나무겨우살이는 여름에 꽃을 피우고 가을에 열매가 열려 겨우내내 붙어 있다.  마주보는 육질의 잎도 Y 자 형태로 늘 붙어 있다.  하지만 꼬리겨우살이는 잎이 얇고 넓으며 겨울이 되면 잎이 지는데 둥글게 생긴 노란열매만 가득 붙어 있게된다.  우리나라 남해안 및 제주도에는 동백나무겨우살이가 있다.  내륙 지역의 겨우살이와는 생김새나 모습 및 맛이 완전히 다르다.

 

송라라고 하는 소나무겨우살이도 겨우살이라 칭하나 엄밀하게는 지의류에 속하는 식물이다.

 

● 한방에서는 요통 및 치통과 같은 통증의 완화, 고혈압 및 동맥경화와 같은 혈액순환개선, 유산방지 및 종양의 제거 등에 이용하고 있으며, 유럽에서도 고대로부터 민간요법으로 간질, 불임 및 고혈압 등에 사용하여 왔고, 1920년대에 독일의 Rudolf Steiner에 의하여 암 치료제로써 제안된 이래, 수술을 전후한 환자의 면역체계를 자극시켜 2차 종양의 재발을 막는 항암면역요법제나 고혈압, 동맥경화와 같은 성인성 질환 치료제로써 사용되고 있다.특히 스위스 Hiscia연구소는 다양한 겨우살이 유전자원을 확보하여 항암제를 상용화 하였고, 독일의 경우도 Helixor사 등에서 자궁경부암 치료용 주사제를 개발한 바 있다.

 

● 안덕균교수의 한국본초도감에 의하면, 겨우살이의 약리작용은 관상동맥 확장작용, 혈류량 증가 등으로 인한 강압작용, 혈소판응집 억제작용, 항혈전작용, 이뇨, 항균작용을 한다. 

 

또한

① 관상동맥 장애로 인한 심장 부위의 통증 및 심박동 이상에 약침 제제로 활용되며,

② 만성기관지염에 진피(陳皮)와 배합하여 현저한 효과를 나타냈다. 

③ 척수회백질염에 음양곽(淫羊藿)과 배합하여 사용하자 항마비치료제로서의 약침 효과가 뚜렷하였다. 

④ 고혈압의 초기 증상에는 유효하나, 말기 증상에는 반응이 없었다. 

⑤ 정신불열증에도 현저한 개선 효과를 나타내었다는 등의 임상보고도 있다.

 

 

 

 

● 겨우살이 관련 발명특허로는,

"항고혈압 활성을 가지는 한국산 겨우살이 추출물 및 활성성분의 추출방법(공개특허-2004-0072193호)"은 겨우살이 추출물이 혈압을 강하시키는 효과를 이용한 것이고, "항당뇨 활성을 가지는 한국산 겨우살이 유래 단백질 및 그 추출방법(공개특허-2009-0084575호)" 은 겨우살이에서 유래한 단백질을 이용하여 인슐린 분비를 유도할 수 있는 단일의 단백질 분획을 획득할 수 있다는 것이며, "운동수행능력 증강 및 피로억제 효과를 갖는 겨우살이 추출물(공개특허 2009-0120348호)"는 겨우살이 추출물 또는 약제학적 조성물은 운동수행능력을 증강시키고 근육 내의 피로를 억제하는 효과가 있어 체력 및 운동능력 증진에 뛰어난 효과가 있다는 것이고,  왜소증 환자들의 치료와 관련되는 "겨우살이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골길이 성장촉진용 조성물(특허등록 10-0818204호)"도 주목되는 발명이다.

 

● 겨우살이의 항산화 효능을 이용한 화장품관련 특허도 있는데,

한불화장품의 "겨우살이 추출물을 함유하는 화장료 조성물(공개특허2003-0005719)"은 겨우살이 추출물이 탁월한 피부 미백효과 및 피부자극 완화효과를 나타내었으며, 이 물질을 이용하여 피부 미백 등 각종 기능성 화장료를 제조할 수 있다는 것이고, 코스맥스주식회사의 "항염증 및 항산화 활성을 갖는 겨우살이 추출물 및 이를 함유한 화장료 조성물(특허등록 10-0642526호)"는 겨우살이로부터 항염증효과, 항산화효과, 피부보호효과 및 노화방지효과를 갖는 화장료를 추출할 수 있다는 것이다.  

 

● 겨우살이는 최근 항암면역요법에 많이 이용되고 있는데,

이는 겨우살이의 우수한 세포살해효과 및 면역증진 효과에 기인하는 것으로써, 비스코톡신(viscotoxins), 알칼로이드(alkaloids) 및 다당류(polysaccharides)와 겨우살이에서 가장 주된 활성을 나타내는 성분인 렉틴 (lectins)에 의해서 그 효력이 유지되는 것으로 알려져 있다.

 

항암관련 특허로는 주식회사 참존의 "한국산 겨우살이의 신규한 항암성 렉틴 및 그 유전자와 렉틴의 분리방법(특허등록 10-0423117호)", 주식회사 미슬바이오텍의 "한국산 겨우살이 추출물과 이로부터 분리한 단백질 및 상기 단백질에서 분리한 렉틴(특허등록 10-0325395호)", 특허등록 10--0335578호의 "겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는 발암예방용 조성물" 등이 있다. 기타 겨우살이를 이용한 특허로는 발명의 명칭으로는 총 53건, 청구범위로는 115건의 특허가 출원된 바 있다.

 

 

※ 한동대 윤, 건양대 유, 건국대 허 등이 대한 약학회지에 기고한 "Antitumor activity of the Korea Mistletoe Lectin is attributed to activation of Macrophages and HK cells"라는 논문의 주요 내용은 미슬토 (겨우살이, KM; Viscum album coloratum))에서 분리된 렉틴 (KML-C)이 쥐 종양세포 (B16-BL6 흑색종, 대장 26M3.1 암종 및 L5178Y-ML25 림프종세포)에 의해 생성되는 종양 전이에 미치는 억제효과를 동계 쥐에서 조사한 결과, 종양 접종 2일 전 KML-C (20-50 ng/mouse)의 정맥 (i.v.) 투여는 B16-BL6과 대장 26-M3.1 세포 모두의 폐 전이를 상당히 억제하였다. KML-C의 50 ng/mouse의 폐전이에 대한 예방적 효과는 100 ㎍/mouse KM의 효과와 거의 동일했다.

 

종양 접종 1일 후 KML-C의 처리는 B16-BL6과 대장 26-M3.1 세포에 의해 유도된 실험적 폐전이뿐 아니라 L5178Y-ML25 세포의 간과 비장 전이도 유의하게 억제시켰다. 또한 종양 접종 후 3일 간격으로 주어진 KML-C의 다중 투여는 폐전이를 유의하게 감소시켰으며, 자연전이 모델 내 B16-BL6 흑색종 세포의 성장을 억제시켰다.

 

자연살해 (NK) 세포 활성에 대한 검정에서는 KML-C (50 ng/mouse)의 투여가 KML-C 처리 2일 후 Yac-1 종양세포에 대한 NK 세포독성을 상당히 증강시켰다. 또한 KML-C (50 ng/mouse)로의 처리는 B16-BL6과 3LL 세포에 대한 복강거식세포의 종양파괴 활성을 유도하였다.

이러한 결과로부터 KML-C이 종양에 대한 숙주방어 시스템을 향상시키는 면역조절 활성을 가지며, 종양 전이에 미치는 예방적 치료적 효과가 NK 세포와 거식세포의 활성화와 관련되었음을 알 수 있었다는 내용이다.

 

겨우살이를 이용한 암치료제는 종래에는 주로 물추출하여 여과멸균하거나, 또는 수추출물을 발효시켜서 주사제의 형태로 생산하고 있으나, 노르웨이의 프라임 아이언의 국제출원특허 "경구섭취 가능한 미슬토 렉틴 제제 및 방법(특허등록 10-832614호)"는 경구 섭취방식의 제제가 주사제 보다 유리하다고 보고하였다. 아래는 그 내용중 일부이다. 

 

렉틴과 면역제어(immunomodulation) 면역체계의 세포독성(cytotoxic) 세포들, 세포용해 T세포(CTL), 자연킬러(NK)세포 및 대식세포(macrophage)들은 스스로 또는 적합한 활성화에 의해 종양세포를 찾아내서 용해시켜버린다. 종양세포에 대한 자발적인 세포독성 활동은 주로 NK세포에 의한 것이다. 다양한 시토카인(cytokine)이 단독으로 또는 조합하여 항종양활성을 증대시키는 것으로 알려져 왔다.

 

: IL-2, IL-7, IL-12 및 IFN-γ는 NK세포와 T세포에서 세포독성 반응을 유발하는 반면, IFN-γ와 TNFα들은 대식세포와 단핵세포(monocyte)의 강력한 활성제(activator)이다. 이러한 효과를 증명한 연구의 대부분이 생체 외에서의 실험으로 제한되어 왔지만, 최근에 이러한 시토카인들의 항암효과가 동물 뿐 아니라 인간에 대한 생체실험을 통해 증명되었다.

 

많은 양 의 IL-2 존재하에 배양된 림프구(lymphocyte)들은 림포카인활성화 킬러(LAK)세포로 불린다. LAK세포들은 NK-저항성 종양세포를 주조직적합성 복합체(MHC) 제한 없이도 죽일 수 있는 능력으로 특징된다. 비록 LAK 활성에 NK세포와 T세포들이 관여하지만, NK세포가 이러한 활성의 대부분을 중개하는데 관여한다.

 

대식세포와 단핵세포들은 종양 주변에 축적되는 것으로 알려져 있다. 상기 세포들의 활성이 TNFα와 IFN-γ에 의해 자극되고 나서, 즉시 이 활성화된 세포들로부터 시토카인이 종양 내로 국부적으로 방출된다. 이것이 차례로 아폽토시스(apoptosis)를 유발시켜, 궁극적으로 종양세포를 죽게 만든다.

 

 

미슬토 추출물과 암치료에의 사용 미슬토 추출물은 특히 오스트리아, 스위스 및 독일의 진료소에서 80년이 넘도록 암치료에 사용되어 왔다. 이런 추출물의 사용은 미슬토의 유효 항암 성분의 실질적인 특성에 관한 지식부족 때문에 화학요법을 신뢰하는 의료업계에 의해 비난받아왔으나 최근의 연구는 미슬토 추출물에 존재하는 정제된 렉틴((ML-I, ML-II 및 ML-III)이 면역제어특성과 세포독성 특성을 둘 다 가지고 있는 것이 명확하게 밝혀졌다.

 

암환자를 치료하기 위한 잘 알려진 임상적인 치료 방법은 피하주입(subcutaneous injection)에 의한 것이었다.그러나, 최근의 연구를 통해서 세륨글리코단백질(serum glycoprotein)이 암환자에게 주입된 미슬토 렉틴에 효과적으로 결합하여 그 효력을 최소화 시킨다는 것이 알려졌다. 이는 피하 경로가 별로 효과적이지 않다는 것을 알려준다. 따라서 대체적인 전달 방법이 요구되고 있다.

 

식이렉틴과 종양의 성장 ML-1의 경구투여에 대한 반응으로, 이식된 NHL 종양에 있어서의 가속화된 세포의 변형으로 인해, 사행성의 비정상적인 죽은 세포의 증가된 영역과 함께 아폽토시스를 일으키는 세포의 수가 증가되고, 렉틴을 먹인 쥐에서 무생육성 세포들이 두배로 증가된 면적을 차지하고 있었다.

아폽토시스는 ML-I을 먹인 쥐의 종양에서 많이 나타나고, 이는 종양의 전이말단과 강력한 림프구 응집체내에서의 무생육성 종양세포들의 눈금말단표지(nick end-labelling) 주변 영역에 의해 인식된다.

종양부위에 대한 형태학적 연구에 의해, 종양의 혈관신생(vascularization) 발생률이 크게 감소하는 것이 확인되었고, 이는 ML-1이 항혈관생성(anti-angiogenic) 인자의 생성을 유도한다는 것을 나타낸다. 정제된 ML-III를 이용한 최근의 실험들을 통해 확립된 NHL 종양을 가지고 있는 쥐에게 렉틴을 먹이면, 더 이상의 종양의 성장을 줄이는데 매우 효과적이라는 것이 밝혀졌다.

 

정제된 미슬토 렉틴이 경구용으로 처방되었을 때 내용력이 있다는 것은 동물 모델들에 있어서 잘 알려졌지만, 정제된 미슬토 렉틴은 매우 비싸고 제조하는데 시간이 많이 들기 때문에 치료방법으로는 이상적이지 못하다. 그래서 경구로 투여할 수 있고, 제조비용이 저렴한 미슬토 렉틴의 제조 및 관련된 치료 방법이 요구된다.

 

미슬토가 독성이 있다고 일반적으로 알려져 있지만, 최근의 연구에서 미슬토의 섭취가 심한 독성과 관련이 없다는 것을 알게 되었다. 그러나 미슬토 추출물에는 구토를 유발하는 성분이 들어 있다.

알칼로이드(alkaloid)와 비스코톡신(viscotoxin)을 포함하는 이러한 구토 유발물질들은 지금껏 미슬토 추출물의 의학적 유효성에 있어 중요한 부분으로 간주되어 왔다(예컨대, 미국특허 제 5,637,563호 및 제 5,547,674호 참고).

본 발명에 의하면, 구토 유발 물질은 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피에 의해 미슬토 추출물로부터 제거된다. 제조된 제제는 렉틴 ML-I, ML-II 및 ML-III로 구성된다. 상기 제제는, 구토를 유발하지 않으며 상기 제제의 생물학적/의학적 효과를 감소시키지 않는 미량의 다른 성분들을 포함할 수도 있다.

 

본 발명의 목적들과 유리한 점 경구투여에 의해 미슬토 렉틴을 제공하는 명확한 장점은 창자 점막에 결합하여 엔도시토시스된 많은 양의 렉틴이 집합임파소절(Peyers Patches)의 림프구로 안 내되어, 주된 시토카인 반응을 유도한다는 것이다. 관찰된 바에 의하면, PHA를 쥐에 먹인 후에 비장 중량의 상당한 감소가 나타난다. 이는 집합임파소절의 림프구로부터 시토카인이 방출되므로써 림프구의 혈액순환내로의 주된 방출 때문일 수 있다. 미슬토 추출물들이 피하로 주사되었을때, 림프조직에 도달할 수 있는 소량의 렉틴에 의해서는 상기의 반응을 일으킬 수 없을 것으로 생각된다. 또한 환자의 관점에서, 미슬토 렉틴 제제를 경구로 투여하는 것이 주사하는 것 보다 훨씬 더 참을만하고, 편하다.

 

 

경구섭취에 의한 면역제어효과에 더하여, 미슬토 렉틴 제제는 또한 직접접촉을 통하여 종양에 대해 직접적인 세포독성효과를 나타낸다. 상기 제제중의 개별적 인 미슬토 렉틴은 2개의 체인 A와 B로 이루어진다. 체인 B는 종양세포 표면의 수용체에 결합하여 체인 A의 엔도시토시스를 일으킨다(체인 A를 종양세포 내부로 내재화). 체인 A는 N-글리코시다제 활성을 나타내고, 그 결과 리보솜 28S RNA를 특이적으로 분해시키고, 더 나아가 단백질 합성을 억제하여 종양세포를 죽게 만든다.

 

출원인은 경구 아르기닌 섭생과 함께 투여되면 미슬토 렉틴 제제의 효과가 증대된다는 것을 밝혀내었다. L-아르기닌은 일반적으로 NO 도너(donor)로 설명될 수 있다. 아르기닌이 종양에서 내피 기능을 증가시켜, 종양 내의 혈관 벽이 단단해져서 글루코스와 단백질이 쉽게 통과할 수 없게 된다. 이는 차례로 종양의 영양상태를 악화시키는데, 이는 미슬토 렉틴 제제의 유사한 메카니즘과 효과를 보조한다. 아르기닌은 또한 면역 시스템을 자극하는 것으로 관찰되었는데, 이것 또한 미슬토 렉틴 제제의 유사한 효과를 보조한다.

 

 

 

 

 

● 겨우살이로 부터 유효성분을 추출하는 방법에 관한 특허로는

우진비앤지 주식회사의 "겨우살이로부터 렉틴을 함유한 추출물의 제조방법"이라는 특허(10-0768282호)는 겨우살이 추출물의 제조방법에 관한 것으로 (1) 약재를 미분쇄하는 단계; (2) 미분쇄된 약재와 물을 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; (3) 상기 현탁액을 효소 처리하는 단계; (4) 효소 처리된 현탁액을 40 내지 65℃의 온도에서 5 내지 10시간 동안 진탕하는 단계; (5) 진탕액으로부터 약재 추출물을 분리하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 약재 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법을 이용하면 종래 방법과 비교했을 때 에너지 소모는 줄이면서도 유효 성분의 추출 효율은 향상시킬 수 있다는 내용이다.

 

또다른 추출법에 관한 학교법인 현동학원의 "한국산 겨우살이로부터 에피오레아놀린산의 분리방법"이라는 특허(10-0490682호)는 겨우살이로부터 분리추출한 항암활성 화합물, 이의 분리방법 및 이를 포함하는 약학적 및 식품학적 조성물에 관한 것으로, 겨우살이를 에탄올 추출한 뒤 상기 추출물을 감압 여과 또는 동결건조하여 얻은 건조물에 물을 가하여 디클로로메탄으로 분배추출한 후 무수황산나트리움으로 탈수하고 여과한 다음 감압 농축하여 항암활성 물질인 에피오레아놀린산이 함유된 디클로로메탄 가용성 추출물을 얻은 뒤 상기 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 다섯 개의 분획으로 나누고 그 중 항암활성이 높은 분획에 대하여 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피를 행하여 백색의 분말상 화합물 VD-3을 순수분리하고 상기 화합물의 이화학적 성상 및 화학적 구조를 확인한 뒤 상기 화합물을 인간 및 마우스유래의 암세포주에 대하여 처리하여 암세포에 대한 세포독성의 활성을 측정함으로서 각종 암세포에 대한 증식억제효과가 뛰어난 항암활성 화합물의 분리가 가능하여 암 예방을 위한 기능성 식품 및 암의 예방 및 치료를 위한 약제산업상 매우 뛰어난 효과가 있다.

 

겨우살이에 함유된 화합물로 렉틴류가 개시되어있으나 렉틴류는 화학적으로 당단백질의 일종으로 본 발명의 트리테르펜의 골격을 갖는 화합물과는 이화학적 성상이 전혀 다른 화합물이다. 또한 에피오레아놀린 산 (epi -oleanolic acid)에 대한 구조 및 이화학적 특성은 이미 밝혀진 바 있으나 암 세포주에 대해 강한 독성을 나타내며 그 활성의 기전이 아폽토시스(apoptosis)에 의한 것임은 본 발명에 의해 최초로 밝혀졌다는 내용이다.

 

 

동백나무겨우살이(Pseudixus japonicus)

 

 

● 겨우살이의 항암 작용기전이 잘 정리되어 있는 발명은

주식회사 바이오메디팜의 "렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는 항암제용 조성물"이라는 특허(공개 10-2003-0028855호)로서 그 내용을 소개하면 아래와 같다.

 

【요약】

본 발명은 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는 항암제용 조성물에 관한 것으로, 겨우살이(Viscum album 및 Viscum album var. coloratum )로부터 분리 정제한 렉틴과 증류수로 추출한 수추출물 및 상기의 렉틴과 수추출물을 혼합한 조성물은 신생혈관억제활성이 있어 암의 전이억제에 뛰어난 효과가 있고, 아폽토시스 유도활성, 텔로메라제 억제활성, 항암활성이 뛰어나며, 국소적으로 환부투여가 가능한 피부암, 구강암, 인두암 등의 치료에 효과적이고, 특히 겨우살이로부터 분리·정제한 렉틴과 수추출물을 혼합하여 제조한 본 발명 조성물은 부작용이 적고 항암활성이 강화되는 뛰어난 효과가 있다.

 

 

【발명의 상세한 설명】

【발명의 목적】

【발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술】

 

본 발명은 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물을 유효성분으로 하는 항암제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 겨우살이(Viscum album 및 Viscum album var. coloratum )로부터 분리 정제한 렉틴과 증류수로 추출한 수추출물 및 상기의 렉틴과 수추출물을 혼합함으로써 신생혈관억제 활성, 암의 전이억제, 아폽토시스 유도활성, 텔로메라제 억제활성, 항암활성이 강화된 약학조성물에 관한 것이다.

 

동백나무겨우살이(Pseudixus japonicus)

 

과학기술의 발전에 따른 의료수준의 급진적인 향상에도 불구하고 악성종양은 발생 및 진행기전이 완전히 밝혀지지 않아 인류의 건강을 위협하는 매우 중요한 요인이 되고 있다. 현재, 암치료법에는 외과적 수술요법, 방사선 요법, 화학요법이 주종을 이루나 전이성 암 및 재발암에 대한 치료는 대부분 불가능한 상태이다. 또한, 지금까지 개발된 항암제는 임상적으로 사용할 때 치명적인 부작용, 내성발현, 임파구 및 골수세포의 파괴 등의 문제점이 있어 보다 효과가 탁월한 암치료제를 개발하는 것이 절실히 요구되고 있는 실정이다. 그러므로 정상세포에는 독성을 나타내지 않고 면역체계를 활성화시킴으로서 암을 치료하려는 노력이 다각도에서 이루어지고 있으며 이를 약으로 개발하는 것은 암 치료 분야에서 중요한 목표가 되고 있다. 이에 따라 최근에는 각종 천연자원으로부터 새로운 항암 성분을 탐색하고 이를 이용하여 항암제를 개발하려는 많은 노력이 진행되고 있다.

 

동백나무겨우살이(Pseudixus japonicus)

 

오래 전부터 암치료제로 사용되어 온 유럽산 겨우살이 (Viscum album )는 부작용이 거의 없으면서 우수한 항암효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다(Hajto 등, Cancer Research 50:3322-3326, 1990., Jassen 등 Drug Research 43(11) 1221-1227, 1993., Am. Soc. for Biochem. and Molc. Biol. 267(33)23722- 23727, 1992). 이 식물은 직접적인 암세포의 살해 및 면역활성화 등의 복합작용에 의하여 효과를 발휘하는데, 체액성 및 세포성 면역체계를 자극하며, 대식세포 및 자연살해(natural killer, NK)세포의 활성을 증가시켜 종양세포의 성장을 억제하고, 암환자의 생존율을 증진시키는 효과가 있는 것으로 보고되었다 (Jassen 등, Drug Research 43(11) 1221-1227, 1993).

 

이 식물에는 렉틴, 비스코톡신(viscotoxin), 다당류 등 각종 활성성분이 함유되어 있는데, 항암활성에 가장 중요한 성분은 렉틴이다 (Bussing 등, Cancer Lett. 94: 199-205, 1995., Cancer Lett. 99: 59-72, 1996., Jung 등. Cancer Letters 51:103-108, 1990). 그러나, 주된 항암성분이 렉틴임에도 불구하고 현재 생산되고 있는 겨우살이 약물은 여러 성분이 복합적으로 함유되어 있는 수추출물이며, 임상적으로도 복합추출물이 렉틴 단일성분보다 효과가 더 우수한 것으로 알려져 있다. 복합추출물이 주성분인 렉틴 단일 성분보다 효과가 우수한 것은 비스코톡신, 알칼로이드(alkaloid) 등 렉틴 이외에 겨우살이에 함유되어 있는 활성성분과의 상승효과 때문인 것으로 추측되고 있다. 또한, 복합추출물에 함유되어있는 렉틴이 순수하게 정제된 형태의 단일성분보다 훨씬 안정성이 높은 것도 중요한 요인인 것으로 추측되고 있다.

 

참나무겨우살이(곡기생)Taxillus yadoriki (Siebold ex Maxim.) Danser의 꽃

 

항암제에 의한 항암효과는 암세포의 비정상적인 증식을 억제하거나 암세포를 죽음으로 유도함으로써 나타난다. 최근, 여러 종류의 항암제나 DNA 손상물질에 의한 종양 퇴행현상이 아폽토시스(apoptosis)라는 특이한 형태의 죽음을 통하여 이루어진다고 밝혀지고 있다. 아폽토시스는 죽음의 신호에 반응하여 일어나는 능동적 죽음의 과정으로서 핵의 응축(nuclear condensation), 막의 기포형성(membrane blebbing) 등의 형태학적 변화와 DNA 분절(fragmentation) 현상이 나타난다. 아폽토시스는 비정상적인 세포의 제거를 위한 방어적인 기전의 역할을 하며 이 과정이 손상되면 항암제에 대한 내성이 생기는 경우도 보고되고 있다. 따라서 항암제의 아폽토시스 유도기전을 밝히는 것이 효율적인 항암제 개발에 매우 중요하다. 겨우살 이의 암세포와 백혈구세포에 대한 강력한 세포독성효과는 아폽토시스의 유도의 결과이며, 겨우살이 성분 중, 렉틴(lectin)만이 아폽토시스에 의한 살해과정을 유도했다고 보고된 바 있다 (Busing 등, Cancer Lett. 94: 199-205, 1995., Cancer Lett. 99: 59-72, 1996).

 

참나무겨우살이(곡기생)Taxillus yadoriki (Siebold ex Maxim.) Danser

 

혈관형성은 종양형성에 있어서 매우 중요한 역할을 담당한다. 혈관형성이 중요한 것은 종양이 형성되어 자라기 위해서는 영양분이 공급되어야 하며, 이 영양분은 바로 혈관을 통하여 수송되기 때문이다. 이에 혈관형성을 억제함으로써 종양세포를 기아상태에서 굶어죽게 하자는 것이 종양치료 전략 중의 하나이다.

지금까지의 아드리아마이신(adriamycin), 시스플라틴(cisplatin), 탁솔(taxol)등의 기존의 항암제는 대부분의 경우가 암세포에 직접 작용하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 화학요법제의 가장 큰 문제점은 암세포가 유전학적으로 불안정하기 때문에 각각의 암세포의 항암제에 대한 내성 세포들이 빈번하게 출현하게 되어 항암제가 효과를 발휘할 수 없게 된다. 더구나 이들 항암제들은 선택성이 결여되어 정상세포나 암세포 모두에 독성을 나타내어 심각한 부작용을 나타내게 된다. 반면 혈관형성저해제는 기존의 항암제와는 다른 양식의 항암제로서 다음과 같은 장점들을 지니고 있다 (Chang 등 Biochem. Biophys. Res Commun., 232: 323-327, 1997).

 

첫째, 혈관신생은 1차 암의 성장이나 암의 전이에 필수불가결하기 때문에 암의 성장과 전이를 동시에 치료할 수 있다.

둘째, 혈관형성 저해제는 홀배수체(aneuploid)인 암세포가 아니라 정상 이배체(diploid)인 혈관내피세포를 표적으로 하기 때문에 암세포와는 달리 이질성(heterogeneity)과 유전적 불안정성 (genetic instability)로 인한 내성 등의 문제점이 일어나지 않을 것이다.

셋째, 혈관형성 저해제는 기존의 항암제와는 달리 특정, 또는 몇몇의 암에만 효능을 나타내는 것이 아니라 혈관형성이 불가결한 모든 고형암에 유효할 것이다.

넷째, 혈관신생은 정상 성인의 경우, 몇몇 특별한 경우, 즉 상처의 치유, 여성의 생리 등을 제외하고는 매우 드문 현상으로 알려져 있다. 따라서 기존의 항암제에서 볼 수 있는 부작용이 크게 감소할 것이다. 이상에서 살펴본 바와 같이 혈관신생은 암의, 특히 고형암의 성장이나 전이에 필수 불가결한 현상이며 항암제로서의 혈관신생 저해제는 기존의 항암제의 큰 문제점인 내성, 부작용 등의 문제를 해결하여 인류의 난치병 중의 하나인 암, 특히 고형암을 보다 효과적으로 치료할 수 있는 매우 희망적인 치료제이므로, 현재 세계 각국에서 angiostatin이나 endostatin과 같은 선택적인 혈관신생저해제의 개발에 많은 노력을 하고 있다.

 

한편, 최근 관심이 집중되고 있는 텔로미어(telomere) 가설은 복제노화현상과 암세포 불멸화를 이해하는데 중요한 분자생물학적인 기전을 제공하고 있다. 대부분의 암조직에서 세포의 불멸화는 텔로머라제(telomerase) 활성을 요구하며 암세포의 성장에 필수적으로 작용하기 때문에 텔로머라제는 암치료에 새로운 세포 내 표적으로 사용될 수 있다. 다양한 암세포 내에서의 텔로머라제의 존재와 정상세포내의 비존재가 이 효소를 항암제의 좋은 목표로 만들었다.

현재 사용 중인 항암제는 암세포는 물론 정상세포도 죽이기 때문에 독성을 보이는 반면, 텔로머라제는 많은 암세포에서 나타나기 때문에 텔로머라제를 파괴할 수 있는 약품은 우수한 항암제가 될 수 있는 것으로 여겨지고 있다. 또한, 텔로머라제에 특이적으로 작용하는 억제제는 정상 체세포의 성장이나 분화에 거의 영향을 미치지 않기 때문에 현재 사용하고 있는 암치료제보다 더 높은 효율의 항암효과를 가지며 부작용의 문제점을 해결할 수 있을 것이다(Holt 등, Mol. Carcinog. 25: 241-248, 1999., Sato 등, Br. J. Cancer. 82: 1819-1826, 2000).

 

참나무겨우살이(곡기생)Taxillus yadoriki (Siebold ex Maxim.) Danser의 꽃

 

유럽산의 변종인 한국산 겨우살이(Viscum album, L. var. coloratum )는 유럽산에 비하여 그 효능이 우수하다고 알려져 있으나 유럽산에 비해서는 연구가 미비한 상태이다 (Park 등 Yakhak Hoeji, 38(4) 418-424, 1994., Yakhak Hoeji, 39(1) 24-30, 1995., Arch. Pharm. Res.: 20 (4) : 306-312, 1997., Arch. Pharm. Res. : 21(4) 429-435, 1998., Foods and Biotechnology : 8 (4) 232-237, 1999).

한국산 겨우살이의 항암효과에 대한 보고에 의하면, 여러 종류의 겨우살이 추출물 중 한국산이 가장 강력한 항암활성을 나타냈으며, 특히 한국산의 알카로이드(alkaloid) 분획은 매우 높은 항암활성을 나타냈다(Khwaja 등. Experientia 36:599-600. 1980., Tasneem 등. oncolgy 43 :suppl. 1. 42-50, 1986).

이 결과는 한국산은 유럽산과는 달리 렉틴 이외의 항암물질의 존재 가능성을 강력하게 시사하고 있으나 그 이상의 연구보고는 없는 실정이다. 한편, 본 연구팀은 한국산으로부터 효과적으로 렉틴을 분리하였으며, 유럽산 렉틴과 유사한 세포독성효과가 있는 것으로 나타났으며, 렉틴을 제거한 추출물 분획은 활성이 거의 없는 것으로 나타났다(Park 등 Food Sci. and Biotechnol.: 8 391-396, 1999., Foods and Biotechnology : 8 (4) 232-237, 1999). 한편, 겨우살이 제제가 직접적인 세포독성작용과 면역활성화에 의한 복합작용에 의하여 그 효능을 발휘한다고 알려져 있 으나, 임상적으로 암환자에게 피하주사로 투여하는 용량 (0.1∼100 mg)으로는 직접적인 세포독성효과는 발휘할 수 없고, 주로 면역활성화에 의한 항암효과가 주된 항암작용기전인 것으로 추측되고 있다.

그러나 만일 이 제제를 환부에 국소적으로 직접투여(intratumoral adminstration)시는 직접적인 세포독성작용과 면역활성화에 의한 복합작용에 의하여 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있는 것으로 추측되고 있다.

 

 

본 발명자는 한국산 겨우살이(Viscum album L. var. coloratum) 유래의 렉틴 단백질의 유전자 및 그 아미노산 서열을 분석하였으며, 컬럼 크로마토그래피를 하여 렉틴을 순수하게 분리하고 상기 분리한 렉틴 단백질이 생체 면역기능을 증강시키고 세포면역능을 유도하는 항암기능이 있음을 확인하고, 효소결합 렉틴 검출법 (ELLA)을 이용한 겨우살이 렉틴의 정량법을 개발하여 특허를 출원하였다.

 

겨우살이는 각종 암세포주에 비교적 강력한 항암활성을 나타냄에도 불구하고 피부흑색종 세포주에는 저항성이 매우 큰 것으로 알려져 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 겨우살이는 추출물의 농도를 50 mg/㎖ 보다 높게 할 경우 침전이 형성되는 문제점이 있다. 또한, 순수하게 정제된 렉틴은 추출물에 함유된 렉틴보다 안정성이 떨어지고, 생체 내에서 내성획득이 더욱 큰 것으로 알려져 있어 이의 개선이 요구되었다.

 

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여, 안정성이 있으며, 활성이 강화된 약물을 개발하던 중 겨우살이를 증류수로 추출한 수추출물에 정제된 렉틴을 첨가하 여 항암활성을 강화시킨 제제가 부작용이 적고 피부암을 포함한 각종 암과 암의 전이억제에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

 

특히, 렉틴으로 강화된 제제(VCES)는 수추출물을 고농도로 제조 시 발생하는 침전 형성문제를 해결하는 동시에 순수하게 정제된 렉틴의 안정성 저하 및 내성획득 등의 문제점을 해결할 수 있는 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 겨우살이 추출물 및 정제된 렉틴이 신생혈관 억제활성 및 텔로메라제 활성 억제능을 갖고 있음을 최초로 밝혀냄으로써 본 발명을 달성하였다.

 

따라서 본 발명의 목적은 아폽토시스에 의한 세포독성, 신생혈관형성억제, 텔로메라제 활성억제에 의하여 항암작용을 하는 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물 및 이를 포함하는 항암제용 조성물을 제공함에 있다. 또한, 약제를 피부암, 구강암, 방광암, 자궁경부암 등 환부에 직접 투여함으로써 항암효과를 발휘할 수 있는 용도를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 겨우살이 수추출물 및 렉틴으로 강화된 겨우살이 추출물의 제조방법을 제공함에 있다.

 

 

 

【발명이 이루고자 하는 기술적 과제】

본 발명의  목적은 겨우살이(Viscum album 및 Viscum album var. coloratum )로부터의 렉틴을 정제하고, 증류수로 추출하여 수추출물을 제조하며 그리고 상기 정제된 렉틴을 수추출물과 혼합하여 항암활성이 강화된 제제를 제조하고, 세포독성활성도, 아폽토시스 유도효과, 종양전이 억제효과, 신생혈관 억제효과, 텔로메라제 억제효과 및 항암효과를 확인함으로써 달성하였다.

(일부생략)

 

실시예 3 : 렉틴으로 강화된 한국산 수추출물(VCES) 및 유럽산 수추출물(VAES)의 제조

상기 실시예 2에서 제조한 한국산 및 유럽산 수추출물(100 ㎎/㎖) 9 ㎖에 실시예 1에서 순수하게 분리한 렉틴(1 ㎎/㎖) 1 ㎖를 첨가하여 추출물의 효능을 강화한 시료(VCES, VAES)를 사용하였다. 이 때 농도의 표시 100 ㎎/㎖ 는 신선한 겨우살이 100 ㎎으로 추출하여 렉틴으로 강화한 용액 1 ㎖를 뜻한다. 따라서, 1 ㎎/㎖ 농도의 VCES 1 ㎖에는 1,030 ng의 VCA가 함유되어 있다.

 

실험예 1 : In vitro 에서 각종 암세포주에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도 측정

(1) 환부에 직접 도포가 가능한 피부암, 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암 세포주에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도 측정

In vitro 에서의 시료를 환부에 국소적으로 직접 투여하여 항암효과를 발휘할 수 있는 각종 암세포에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도를 측정하기 위하여 MTT분석을 실시하였다. 즉, 이들 암은 절개하지 않고, 직접 환부에 약제를 도포하여 치료할 수 있는 부위의 암이라는 특징이 있다. 따라서 전신작용이 아닌 국소작용에 의한 항암효과를 기대할 수 있기 때문에 종래의 기술과는 다른 새로운 투여방 법이라고 할 수 있다. 암세포주는 피부암 시험 대상으로는 in vivo 시험을 수행하기 위하여 mouse로부터 유래한 B16-BL6 melanoma 세포를 사용하였으며 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암 시험 대상으로는 사람으로부터 유래된 암세포주를 사용하였다. 암세포 일정량을 96 well plate에 넣고 다양한 농도의 시료를 첨가하고 48시간 후에 MTT법에 의한 세포의 성장을 조사하여 각 종양세포주의 성장을 50% 억제한 시료의 농도인 IC50 (inhibitory concentration)값으로 나타내었다.

 

 

실험결과 표 1에 나타난 바와 같이, 수추출물(VCE)은 B16-BL6 melanoma 세포주에서 비교적 높은 저항성을 나타낸 반면, 렉틴으로 강화된 겨우살이 수추출물(VCES)은 수추출물(VCE)보다 훨씬 낮은 농도에서 활성을 나타내는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다. 즉, B16-BL6 melanoma 세포에 대한 VCA의 세포 독성 활성도 (IC50 )는 30.0 ng/㎖, VCE는 120 ㎍/㎖(VCA 함량: 3.6 ng/㎖), 그리고 VCES는 15 ㎍/㎖ (VCA 함량: 15.5 ng/㎖)이었다. VCA의 함량으로 환산한 항암활성(IC50 )을 고려해 볼 때, 수추출물(VCE)은 VCA 단독으로 사용할 때보다 낮은 농도의 렉틴에 의하여 활성을 발휘하는 것으로 보아 VCA 이외의 성분과 상승효과가 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 렉틴으로 강화한 수추출물(VCES)의 IC50 는 수추출물보다 0.125배 감소한 것으로 보아, 이와 같은 방법은 항암효과를 강화시키면서 수추출물을 고농도로 제조시 침전이 형성되는 문제를 해결할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 그리고, 피부암 외에 국소작용에 의한 항암효과를 기대할 수 있는 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암세포에 대한 VCA, VCE, VCE의 IC50 를 측정한 결과, 암세포에 따라 활성이 다른 것을 알 수 있었다. 렉틴(VCA)으로 강화된 제제(VCES)의 경우, 피부암 세포주와 유사하게 수추출물보다 훨씬 낮은 농도에서 활성을 나타내며, 특히, 방광암 세포주인 T24의 경우 VCE에 대하여 높은 저항성을 나타내나 VCES에 대하여는 저농도에서 활성이 나타나는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다. 또한, VCA로 강화한 유럽산 수추출물(VAES)의 경우, 한국산인 VCES보다 전반적으로 약간 높은 농도에서 활성이 나타났으나, 수추출물(VCE)의 경우보다는 낮은 농도에서 활성이 나타나는 것으로 보아 유럽산 추출물도 한국산과 동일하게 VCA로 강화하면 직접 도포에 의한 피부암, 구강암, 인두암, 자궁경부암, 방광암세포에 대한 항암효과를 강화할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

 

 

 

간암, 위암, 유방암, 혈액암 세포주에 대한 VCA, VCE, VCES의 세포독성 활성도 측정

한국인에게 빈발하는 간암 및 위암, 그리고, 유방암, 혈액암에 대한 시료의 항암활성을 측정하기 위하여 MTT분석을 실시하였다. 사람으로부터 유래된 암세포 일정량을 96 well plate에 넣고 다양한 농도의 시료를 첨가하고 48시간 후에 MTT법에 의한 세포의 성장을 조사하여 각 종양세포주의 성장을 50% 억제한 시료의 농도인 IC50 (inhibitory concentration)값으로 나타내었다. 실험결과 표 2에 나타난 바와 같이, 수추출물(VCE)은 각종 암세포주에서 비교적 높은 저항성을 나타낸 반면, 렉틴으로 강화된 겨우살이 수추출물(VCES)은 수추출물(VCE)보다 훨씬 낮은 농도에서 활성을 나타내는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다. 특히, 간암 세포주인 SK-Hep-1의 경우 VCE에 대하여 높은 저항성을 나타내나 VCES에 대하여는 저농도에서 활성이 나타나는 것으로 보아 효능이 증강된 것으로 판단되었다.

 

실험예 2: 아폽토시스 유도효과 측정

(1) B16-BL-6 melanoma cell에 대한 세포핵 염색 및 DNA 분절(fragmentation)에 의한 아폽토시스 유도효과 측정

시료에 의한 B16-BL-6 melanoma cell의 아폽토시스 유도효과를 확인하기 위하여 세포핵 Hoechst 33258 염색에 의한 현미경 관찰과 DNA 분절을 확인하였다. 시료를 48시간동안 처리한 B16-BL6 melanoma 세포를 PBS 완충용액으로 세척 후 추출용 완충액을 가하여 배양한 후, 단백질을 제거하고 얻어진 수층에 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)와 무수 에탄올을 넣어 DNA 침전물을 얻었다. TE 완충액으로 다시 현탁하고, RNA를 제거후 아가로즈 겔에 시료를 loading 후 DNA 분절을 관찰하였다. 현미경 관찰 결과(도 1)에 의하면 VCA 처리(도 1B) 혹은 VCES (도 1C)에 의하여 전형적인 아폽토시스 모양인, 세포의 위축, 염색체의 응축, 그리고 아폽토시스 체(apoptotic body)들이 관찰되었다. 도 2는 DNA 분절 관찰 결과이며, 농도 의존적으로 DNA 분절이 증가하며, VCES (도 2D)의 경우가 VCE (도 2C)의 경우보다 낮은 농도에서 뚜렷이 나타나는 것이 관찰되었다.

(2) 겨우살이 렉틴(VCA)의 구강암 및 간암세포에 대한 형광분석법(FACS)에 의한 아폽토시스 유도효과 확인

시료 처리에 의한 A253 구강암 세포 및 Hep3B 간암세포의 아폽토시스 유도효과를 확인하기 위하여 형광분석(FACS)을 실시하였다. 시료를 처리한 세포를 냉 70% 에탄올에서 24시간동안 고정하고, 인산완충액(PBS)으로 철저하게 세척하였다. 50 ㎍/㎖의 propidium iodide 와 100 ㎍/㎖의 RNAase가 함유된 DNA 염색용액과 함께 실온에서 30분간 배양시킨 후, FACS flow cytometer (Becton Dickinson Instruments)에 의하여 분석하였다. 아폽토시스는 각 세포주기에서의 백분율로 나타내었다. 도 3은 A253 구강암세포및 Hep3B 간암세포의 형광분석 결과이다. VCA를 48시간동안 처리한 A253 구강암 세포의 경우 25%의 아폽토시스가 나타났으며, Hep3B 간암세포의 경우 64.6%의 아폽토시스가 나타났다. 따라서 겨우살이 렉틴(VCA)의 항암효과는 아폽토시스 유도효과에 의한 것을 확인할 수 있었으며, 아폽토시스 유도는 세포주에 따라 차이가 큰 것을 알 수 있었다.

 

실험예 3 : 겨우살이 렉틴(VCA)의 암세포에 대한 텔로메라제 (telomerase) 억제효과 확인

시료의 텔로메라제 억제효과에 의한 항암효과의 가능성을 확인하기 위하여 TRAPEZE telomerase detection kit를 사용하여 DNA를 검색하였다. PCR 산물은 12% 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔에서 전기영동을 실시한 후 SYBR GREEN DNA 염색시약으로 확인하였다. 각 레인에서 텔로메라제의 양을 확인하기 위하여 전체 ladder의 농도를 NIH-image software로 측정하였다.

도 4는 구강암(A253, KB), 인두암(FaDu), 간암(SK-Hep-1, Hep3B)세포에 대한 겨우살이 렉틴(VCA)의 텔로메라제 억제효과 측정결과와 피부암(B16-BL6 melanoma)세포에 대한 렉틴으로 강화한 수추출물(VCES)의 텔로메라제 억제효과 측정결과이다. 시험한 모든 세포주에서 시료처 리 시간이 길어질수록 텔로메라제 억제효과가 현저히 나타났다. 구강암 세포주인 KB의 경우, 48 시간 처리 시는 효과가 크게 나타나지 않았으나 72 시간 처리 시 대조군에 비하여 텔로메라제가 10%로 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 인두암 세포주인 FaDu 및 간암 세포주인 SK-Hep-1 그리고 Hep3B의 경우 렉틴 처리 후 12시간부터 텔로메라제 억제효과가 나타났다. 특히, 간암의 경우 VCA의 SK-Hep-1 세포에 대한 텔로메라제 억제효과는 Hep3B 세포에 비하여 현저히 큰 것으로 나타났다. 또한, 피부암 세포주(B16-BL6)의 경우 VCES 처리후 24시간부터 텔로메라제 억제효과가 현저히 나타났다. 결과적으로 겨우살이의 주된 항암물질인 렉틴(VCA)은 텔로메라제 억제효과에 의한 항암효과를 발휘하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 렉틴으로 강화된 수추출물(VCES)의 항암효과도 텔로메라제 억제효과에 의한 항암효과를 발휘하는 뛰어난 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

 

실험예 4: In vivo 에서 종양전이 억제효과 측정

시험물질의 종양전이에 미치는 효과는 폐에 대하여 전이력을 획득한 고전이성 종양세포주인 B16-BL6 melanoma를 사용하였다. 종양전이를 위한 실험동물은 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, in vitro에서 배양된 종양세포주를 정맥주사로 접종하였다. 시험물질에 의한 종양의 전이억제 효과의 조사는 group당 5마리의 마우스에 여러 농도의 시험물질을 종양접종 2일 전과 1일 후 주사하였으며, 시료에 의한 종양전이의 억제효과 측정은 종양만 접종한 시료 무처리의 대조군에 전이된 종양의 군집(colony) 수와 비교함으로서 판단하였다(표 3). 전이된 종양의 판정은 종 양접종 14일 후에 마우스를 희생시켜 종양의 표적기관인 폐를 적출한 후 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정 후 종양의 군집 수를 셈하였다. VCA 투여군은 마리 당 200 ng 이상, VCE 투여군은 1 ㎎ 이상, 그리고 VCES 투여군은 1 ㎎ 이상 투여 시는 80% 이상 폐사하는 것으로 보아 각 시료를 높은 농도로 투여 시는 독성이 있는 것으로 판단되었다. 그러나, 각각 그 이하의 농도에서는 농도 의존적인 유의할만한 전이억제효과를 나타냈다. 특히 VCES 투여군은 VCA 및 VCE에 비하여 독성은 감소한 반면, 전이억제효과는 훨씬 증가하는 것으로 나타났다.

 

실험예 5: In vivo 에서 신생혈관억제 효과 측정

CAM assay (Oikawa, 1998)를 이용하여 신생혈관억제효과를 확인하였다. 수정 란을 37℃에서 3.5일 동안 배양 후, 계란의 좁은 끝 부분에 만들어진 작은 구멍을 통하여 CAM(막)과 노른자위 주머니가 계란껍질 부분으로부터 떨어져 나오도록 하면서 알부민(albumin) 3 ㎖를 주입하였다. 공기주머니를 덮고있는 껍질 부분은 구멍을 내고 제거한 후 바깥부분에 있는 막은 벗겨내었다. 4.5일에 1 ㎕의 시료로 덮은 커버 글래스(cover glass)를 CAM에 놓는다. 병아리 배아를 2일동안 배양 후, 10% 지방 현탁액 적량을 배아 장요막(奬尿膜; embryo chorioallantois)에 주입한 후, 6.5일이 되면 계란을 현미경으로 관찰하였다. 각 농도마다 20개의 수정란을 사용하였다. 음성 대조군에는 인산 완충액(PBS)을 처리하였으며 양성 대조군에는 레티노산 (RA;retinoic acid)을 처리하였다.

실험결과 표 4 및 도 5(VCA 경우), 도 6(VCE 경우), 도 7(VCES 경우)에 나타난 바와 같이, VCA는 25 ng/㎖에서, 그리고 VCE는 50 ㎍/㎖에서 양성 대조군보다 높은 활성을 나타냈다. VCES의 경우에는 20 ㎍/㎖에서 양성 대조군보다 높은 활성을 나타냈으며, 그 이상의 농도에서도 VCE보다 높은 활성을 나타냈다.

 

실험예 6: 생존률 측정에 의한 항암효과 측정

항암효과를 확인하기 위하여 암을 생체내에 미리 접종하여 암의 성장을 억제하는지의 여부를 검색하였다. 1×105 의 B16-BL6 melanoma 세포를 syngeneic mice에 피하주사로 접종하였다. 2주 후 각각 10 마리의 실험군에게 1주일에 3회씩 복강으로 시료를 주사하였으며, 대조군에게는 인산완충액을 주사하였다.

실험결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 모든 실험동물에게서 암의 발생이 확인되었으며 시료의 처리는 종양의 발생을 정지시키지는 못하였다. 그러나, 시료를 처리한 군은 대조군에 비하여 생존기간이 증가하였으며, 특히, VCES의 처리군은 효능이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 도 8은 VCA를 마리 당 10 ng, 100 ng을 각각 투여한 결과이며, 10 ng 처리군이 100 ng 처리군보다 생존률이 약간 높은 것으로 나타났다. 도 9는 VCE 및 VCES를 마리당 100 ㎍를 투여한 결과이며, VCES를 처리한 군의 생존률이 가장 큰 것으로 나타났다. 따라서 렉틴으로 강화한 추출물인 VCES는 부작용은 감소하면서 효능은 강화된 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

 

실험예 7: 겨우살이 렉틴(VCA)으로 강화한 수추출물의 임상적인 항암효과 확인

본 실험의 대상은 1998년 4월 연세대학교 신촌 세브란스 병원에서 방광암 진단을 받고 방사선치료를 받았으나 악화되어 식욕부진, 체중감소, 통증, 혈뇨 등으로 심한 고통을 받고 있던 박원문씨이다. 본 발명자는 박원문씨에게 실시예3에서 제조한 렉틴을 강화한 수추출물(100 ㎎/㎖) 10 ㎖를 생리식염수 100 ㎖에 혼합하여 카테타를 통하여 방광에 주입한 후 1 시간동안 안정을 취하도록 하였다. 2일에 한번씩 3회 투여 후 환자는 통증 및 혈뇨가 현저하게 감소하였다. 한달 후, 식욕부진, 체중감소, 통증, 혈뇨 등 암으로 인한 모든 고통이 사라졌고, 부작용은 전혀 나타나지 않았다. 그 후 지속적인 처치를 계속하였고, 병원에서 방광의 종양이 거의 사라진 것을 확인할 수 있었으며, 현재, 정상적인 생활을 영위하고 있다.

또한, 투병과정에서 동일환자는 오른손등의 심한 가려움을 호소하였고, 피부가 심하게 손상되도록 긁어 출혈, 궤양 등을 유발하였다. 병원에서 피부암으로 진 단하였고, 방사선 조사 후 약간 호전되었으나 도로 재발되는 등 치유가 되지 않았다. 역시 본 발명자가 고안한 렉틴을 강화한 수추출물(100 ㎎/㎖)을 환부에 수시로 도포한 결과, 가려움증이 사라지고 수 주 후 궤양의 흔적도 거의 사라졌다.

상기와 같은 결과는 본 발명자가 고안한 렉틴을 강화한 수추출물(100 ㎎/㎖)을 방광암, 피부암 등의 환부에 직접 도포함으로써 부작용이 없이 항암효과를 발휘할 수 있는 뛰어난 효과가 있는 것을 임상적으로 확인할 수 있었다.

 

 

【발명의 효과】

이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명 한국산 겨우살이로부터 분리 정제한 렉틴, 증류수로 추출한 수추출물 및 렉틴과 수추출물의 혼합한 조성물은 신생혈관억제 활성이 있어 암의 전이억제에 뛰어난 효과가 있고, 아폽토시스 유도활성, 텔로메라제 억제활성, 항암활성이 뛰어나며, 국소적으로 환부에 투여가 가능한 피부암, 구강암, 방광암, 자궁경부암 등의 치료에 효과적이고, 특히 한국산 겨우살이로부터 분리·정제한 렉틴과 수추출물을 혼합하여 제조한 추출물은 부작용이 적고 항암활성이 강화되는 효과가 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

 

● 동인당한방병원의 하 등이 대한한방부인과학회지에 기고한 "전이된 유방암환자에 대한 미슬토(Mistletoe)를 사용한 면역요법의 임상례"이라는 논문은 미슬토요법으로 말기 암환자를 치료한 임상보고서이다. 다수 말기 암환자는 기존의 암으로 인한 임상증상 외에도 항암치료로 인한 부작용으로 골수억제에 의한 빈혈, 오심, 구토, 탈모와 임파부종 등을 나타내는 경우가 많다. 연구자는 겨우살이, 즉 미슬토(Mistletoe)를 사용한 치료법이 이러한 말기 암환자들의 증상을 개선하고 악성신생물의 증식과 전이를 억제하는데 부분적인 효과를 나타내므로 이에 전이된 유방암환자 3명에 대한 임상례를 보고하였다. 겨우살이 추출액의 주요 성분들로는 렉틴, 다당류, 펩티드, 그리고 세포독성 알카로이드가 있다. 이 성분들은, IL-1, IL-2, IL-6, INF- r , TNF- α 등의 사이토킨들을 활성화시키며, 이것들은 항원(抗原)으로 인식되는 종양 세포들을 제거하는 NK 세포들을 끊임없이 활성화시킨다. 결론적으로, T-세포 방식은 종양세포들의 증가 및 전이를 막아준다. 우리는 제4기 유방암 환자들에게 겨우살이 추출액을 주사하고자 했으며, 증상 및 일반적 상태의 호전 가능성에 대한 조사 결과들을 연구했다. 제4기 유방암환자에 대한 겨우살이 추출액의 피하 주사 혹은 정맥 주입으로 치료한 결과, 겨우살이가 부분적으로 효과가 있었지만, 환자의 상태에 따라 더 이상 미슬토 요법이 의미가 없어지는 경우(cass1)도 있었다는 보고이다. 연구자들은

1. 미슬토요법만 단독적으로 시행하는 것보다 수술후 화학요법 등과 병행할 때 좋은 효과를 기대할 수 있다.

2 .미슬토요법으로 암성 통증의 진정작용은 기대하기 어렵다.

3. 미슬토요법은 암을 직접 제거하는 치료법이라기 보다는 암에 대한 저항력을 높여 암세포의 증식과 전이를 억제할 수 있는 면역요법의 일종이다.

4. 말기 암환자에게 있어서 미슬토는 완치적 접근이 아닌 완화적 치료 접근방법이다라고 결론지은 바 있다.

 

 

 

 

● 겨우살이의 효능에 대한 여러가지 연구나 그 결과물인 특허들을 종합하면,

겨우살이는 항암, 항당뇨, 혈압강하, 노화방지, 성장촉진, 피로를 억제하는 효과 등 다양한 약리작용을 가지는 약초로서 BT산업에서 여러모로 활용될 수 있는 중요한 천연물 중의 하나임은 분명하다.

그러나 항암의 대체요법과 등과 관련하여 겨우살이의 효능을 맹신하는 것은 상당히 위험한 접근방식이라고 할 수 있다. 임상적으로 암환자에게 피하주사로 투여하는 용량으로는 직접적인 세포독성효과는 발휘할 수 없고, 주로 면역활성화에 의한 항암효과가 주된 항암작용기전인 것으로 이해되고 있기 때문이다.

또한 환부에 국소적으로 직접투여(intratumoral adminstration)시는 직접적인 세포독성작용과 면역활성화에 의한 복합작용에 의하여 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있는 것으로 추측되고 있지만 아직은 이에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 풍부한 생약자원의 하나인 겨우살이에 대한 심도있는 연구는 계속되어야 할 것이다. 

 

 

사진출처,: http://blog.daum.net/ch66da/13351001